新稿速递┃高效液相色谱-串联质谱法测定多种食品中7种酚类抗氧化剂和对羟基苯甲酸酯类防腐剂
高效液相色谱-串联质谱法测定多种食品中7种酚类抗氧化剂和对羟基苯甲酸酯类防腐剂
摘 要：针对多种食品基质(水果罐头、腌鱼罐头、白酒、果酒、饮料、海鲜酱油、糖果、糕点、调味酱和泡菜)，建立了同时测定2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)、 特丁基对苯二酚(TBHQ)、对羟基苯甲酸甲酯(MP)、对羟基苯甲酸乙酯(EP)、对羟基苯甲酸丙酯(PP)和对羟基苯甲酸丁酯(BP)残留量的高效液相色谱-质谱联用分析方法。样品经饱和无水Na2SO4溶液(用磷酸调 pH值至 2 ～3)和乙腈提取各种样品中的待分析物，考察了提取溶剂、净化方式对抗氧化剂和防腐剂萃取量的影响。萃取液经色谱柱Kromasil 100-5 (150 mm×2.1 mm×5.0μm)分离，进行MRM多反应监测扫描，外标法定量。结果表明：7种抗氧化剂和防腐剂呈良好的线性关系(r2=0.992 8～0.999 6),方法的测定低限为0.03～0.14 mg/kg，进行低、中、高3个浓度水平的添加实验的平均回收率为85.8%～97.0%，相对标准偏差为1.43%～4.18%(n=10)。该方法准确、灵敏度高，重现性好，适合于多种食品中7种抗氧化剂和防腐剂的检测。
关键词：抗氧化剂；防腐剂；高效液相色谱-串联质谱法
食品抗氧化剂和防腐剂是最常见的食品添加剂。在食品中加入抗氧化剂，可以阻止或延缓食品的氧化过程，从而提高食品的稳定性和延长食品贮存期。2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)和特丁基对苯二酚(TBHQ)是我国允许在食品中添加的3种较常使用的油溶性酚类抗氧化剂，它们具有淬灭单线态氧、清除自由基和抑制氧化酶活性的的功能。但是大量添加抗氧化剂会对人体健康产生危害，例如BHT可以抑制人体呼吸酶的活性，大剂量的BHA对人体具有致癌作用等[1-4]。在食品中加入防腐剂可以防止或延缓食品因微生物、酶或化学变化而导致食品中营养物质的损失或食品变质。在食品中经常使用的防腐剂有对羟基苯甲酸甲酯(MP)、对羟基苯甲酸乙酯(EP)、对羟基苯甲酸丙酯(PP)和对羟基苯甲酸丁酯(BP)这4种对羟基苯甲酸酯类防腐剂。在食品中加入过量的防腐剂会给人体的健康带来危害，特别是会对人体的脏器造成损伤[5-7]。因此在中国食品添加剂使用标准(GB 2760—2014)中对上述7种抗氧化剂和防腐剂规定了在食品中的最大使用限量给出了明确规定，BHT和BHA在胶基糖果里的最大允许使用量为0.4 g/kg，在其他允许添加的食品中，最大允许使用量为0.2 g/kg；TBHQ在允许添加的食品中，最大允许添加量为0.2 g/kg；对羟基苯甲酸酯类防腐剂(以对羟基苯甲酸计)在经表面处理的鲜水果和蔬菜中最大允许添加量为0.012 g/kg，在焙烤食品及表面挂浆中最大允许添加量为0.5 g/kg，在热凝固蛋制品及碳酸饮料中最大允许添加量为0.2 g/kg，在其他允许添加的食品中最大允许添加量为0.25 g/kg。
目前对于抗氧化剂和防腐剂的测定方法有多种，分别有气相色谱法、液相色谱法、红外光谱法、毛细管电泳法、薄层色谱法和色谱-质谱联用技术等。文献报道了食用油、食醋、油炸食品和食品包装材料等中抗氧化剂残留量的测定，火锅底料、葡萄酒、月饼和化妆品中防腐剂残留量的测定，但是所涉及的样品基质种类较少且对于常用抗氧化剂和防腐剂通过高效液相色谱-质谱联用技术同时进行检测的报道较少。文献中大多采用甲醇、乙腈等有机溶剂直接提取或在提取液中加入盐(如氯化钠)的固体颗粒进行提取，这种提取体系对于一些含水量较少的样品(如糕点)不能使杂质如糖类和蛋白质充分分散在水相中，造成提取效率较低[8-10]。随着当前社会食品安全问题越来越严重，公众对食品安全的关注度越来越高，有必要基于多种样品基质种类，在优化前处理方法和净化方法的基础上，建立一种能够同时测定食品中普遍添加的抗氧化剂和防腐剂残留量的高效液相色谱-串联质谱法来应对食品检验的需要。
本研究以水果罐头、腌鱼罐头、白酒、果酒、饮料、海鲜酱油、糖果、糕点、调味酱和泡菜这10种食品为基质，建立了能够同时测定7种添加剂(3种抗氧化剂和4种防腐剂)残留量的方法。实验结果表明，该方法准确、快速、灵敏度高，为上述10种食品中7种抗氧化剂和防腐剂的检测提供了高效的技术手段。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂
API 4000Q液相色谱-串联质谱仪(配有电喷雾离子源(ESI)，美国AB公司)；电子天平(感量为0.1 mg和0.01 g，德国梅特勒公司)；涡旋混合器(美国Scientific industries公司)；超声波清洗器 (中国天津AUTO Science 公司)；高速冷冻离心机(最大转速在4 000 r/min以上，美国贝克曼库尔特公司)；真空旋转蒸发仪(美国 Scientific 公司)；C18固相萃取柱(Envi-Carb，6 mL,1.0 g，北京振翔公司)；聚丙烯离心管(50 mL，具塞)，微孔滤膜(有机系，0.22 μm)。
乙腈、甲醇为色谱纯试剂；无水Na2SO4、H3PO4为分析纯试剂；标准物质购自国药集团化学试剂有限公司，纯度均大于等于97%，抗氧化剂包括2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol，CAS NO.128-37-0，C15H24O)、丁基羟基茴香醚(butylated hydroxyanisole，CAS NO.25013-16-5，C11H16O2)和 特丁基对苯二酚(tert-Butylhydroquinone，CAS NO.1948-33-0，C10H14O2) ；防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯(4-Hydroxybenzoic acid-methyl ester，CAS NO. 99-76-3，C8H8O3)、对羟基苯甲酸乙酯(4-hydroxybenzoic acid-ethyl ester，CAS NO. 120-47-8，C9H10O3)、对羟基苯甲酸丙酯(4-hydroxybenzoic acid-propyl ester，CAS NO. 94-13-3，C10H12O3)和对羟基苯甲酸丁酯(4-Hydroxybenzoic acid-iso-butyl ester，CAS NO. 94-26-8，C11H14O3)；标准储备溶液：准确称取标准品0.025 0 g，用甲醇定容至25 mL,配制成1 000 mg/L的单标储备液，置于0～4 ℃冰箱中保存；标准工作溶液：根据需要用甲醇稀释配制合适浓度的溶液，现用现配。
1.2 液相色谱与质谱条件
液相色谱条件：色谱柱： Kromasil 100-5 C18，150 mm×2.1 mm ，粒度5.0 μm或相当者；柱温：40 ℃；进样量：5 μL；流动相：A：甲醇，B：体积分数0.1%甲酸水(含0.02 mol/L乙酸胺)；梯度：t=0 min，55% A ，45% B；t=40.0 min时，90% A ，10% B；t=40.1 min时，100% A；t=42.0 min，100% A ；t=42.1 min时，55% A，45% B；t=48.0 min时，55% A，45%B；流速：0.25mL/min。
质谱条件：离子源：电喷雾Turbo Spray，负离子扫描；气路参数：CUR: 13.00 Psi；GS1: 20.00 Psi；GS2:20.00 Psi；IS:-4 500.00 V；离子源温度(TEM):550.00 ℃；CAD:6.00 Psi；扫描方式：多反应监测(MRM)；气帘气(CUR)：13 Psi；雾化气(GS1)：20 Psi；辅助气(GS2)：20 Psi；电喷雾电压(IS)：-4 500.00 V。
1.3 样品预处理，提取与纯化
1.3.1 样品的预处理
1.3.1.1 水果罐头、腌鱼罐头
样品经室温下开罐后，将罐内的固形体和液体分开并分别称重，按照两者的比例称取1 kg具有代表性的样品，经组织捣碎机捣碎并混匀后，分装入洁净的容器内作为待测试样，并将试样置于0～4 ℃保存。
1.3.1.2 白酒、果酒、饮料、海鲜酱油
将所取样品充分振荡混匀，分装在洁净容器内作为试样，置于0～4 ℃下保存。
1.3.1.3 糕点、糖果、调味酱、泡菜
将所取样品在玻璃研钵中研碎，并混匀后分装在洁净容器内作为试样，置于0～4 ℃下保存。
1.3.2 样品的提取
准确称取固体试样1.0 g(精确至0.01 g)或准确量取液体试样2 mL，置于50 mL离心管中，加入 5 mL 饱和无水Na2SO4溶液( 用H3PO4调pH值至 2 ～3)，涡漩振荡 1 min ，使试样在饱和无水Na2SO4溶液中充分分散，加入20 mL乙腈，于超声波清洗器中超声20 min后，再于4 000 r/min速率下离心5 min，离心后用移液枪或胶头滴管移取上清液于100mL浓缩瓶中。残渣再用10 mL乙腈超声提取10 min，经离心后，合并上清液，于40 ℃水浴中旋转浓缩至约2 mL，待净化。
1.3.3 样品的净化
先用10 mL甲醇预淋洗C18固相萃取小柱，然后将提取浓缩后约2 mL溶解液倾入C18固相萃取小柱中，再用15 mL甲醇进行洗脱。收集全部洗脱液于100 mL的浓缩瓶中，于40 ℃水浴中旋转浓缩至近干。最后用2 mL甲醇复溶后过0.22 μm滤膜，供液相色谱-质谱/质谱测定。
2 结果与讨论
2.1 提取溶剂的优化
对本实验7种目标化合物的提取效果需要综合所提取物质的极性与样品基质的种类进行考虑。本实验所测定的抗氧化剂和防腐剂的极性都中等偏强，所以应选择极性较强的提取溶剂，分别采用甲醇、乙醇和乙腈作为溶剂对实验样品进行提取，以不含以上所测抗氧化剂和防腐剂的糕点、果酒、腌鱼罐头、饮料作为空白样品基质，进行1倍测定低限浓度水平添加实验，在实验过程中分别用甲醇、乙醇和乙腈作为提取溶剂，其他步骤相同，实验结果表明，甲醇和乙腈的提取效果要比乙醇好，用甲醇提取时，提取液中色素含量较高，水含量较大，在后期进行40 ℃水浴中旋转蒸发浓缩过程时，很难旋至近干，因此本实验最终选取了乙腈作为提取溶剂。本实验测定的抗氧化剂与防腐剂很多都是有机弱酸，当其所处的环境pH值比本身pKa值低2个单位时，容易被有机溶剂所萃取。以不含以上所测抗氧化剂和防腐剂的糕点、果酒、腌鱼罐头、饮料作为空白样品基质，进行一倍测定低限浓度水平添加实验，在实验过程中用乙腈作为提取溶剂，两组对比实验中，一组加5 mL饱和无水Na2SO4溶液(pH值为2～3)，另一组不加，其他步骤相同，经过实验证明，当直接用乙腈提取时，有些蛋白质和糖类含量比较高的样品会在乙腈中聚集成团，使得目标分析物被样品颗粒包裹，降低提取效率。当在用乙腈提取前，加入饱和无水Na2SO4溶液(pH值为2～3)对样品进行稀释时，在水相中可以保留多数的蛋白质和糖类，从而除去杂质，再加入乙腈后，可以使抗氧化剂和防腐剂更容易被乙腈萃取。所以本实验在提取过程中先加入饱和无水Na2SO4溶液(pH值为2～3)，然后再加入乙腈进行提取。糕点作为空白基质的实验数据如图1，其他3种基质的实验结果与糕点作为空白基质的实验结果具有相同的规律。
图1 提取溶剂对回收率的影响
Fig.1 The impact of the extraction solvent on recovery
2.2 净化方式的选择
图2 待测物经C18固相萃取柱的洗脱曲线
Fig.2 The elution curve ofanalyte by C18 solid extraction column
固相萃取技术(SPE)是一种基于液相色谱分离机制的样品净化方法，这种方法根据待分析物与样品杂质在溶剂和吸附剂中分配系数的差异，通过选择合适极性的溶剂和体积分别进行淋洗和洗脱过程，使待分析物与样品杂质依次从固定相解吸以实现对分析样品的净化过程，由于其采用了高选择性和高效的固定相，从而减少了有机溶剂的用量，使得方法简便快速，已广泛应用于有害有毒物质的残留检测工作。由于本实验所选的10种样品基质比较复杂，特别是水分和色素含量相对较高，传统的净化方法例如液-液萃取法(LLE)已不能有效地对样品进行净化，从而对液相色谱-质谱/质谱多组分残留测定存在较大的干扰，并且对色谱柱的灵敏度、分离度和质谱离子源的污染及使用寿命存在潜在的影响。因此，确定对提取样品进行固相萃取净化(SPE)，采用C18固相萃取柱除去部分油脂和色素，从而保证了本方法具有良好的精密度和重现性。本方法采用固相萃取柱净化，并对净化效果进行了条件试验，以观察C18固相萃取柱对上述7种食品添加剂在不含所测抗氧化剂和防腐剂的糕点、果酒、腌鱼罐头、饮料4种样品基质中的分离净化效果。即分别将7种食品添加剂进行了1倍测定低限浓度水平添加实验，分别添加到采用上述实验步骤提取的糕点、果酒、腌鱼罐头、饮料等4种食品的空白样液中，分别按照规定的条件通过C18固相萃取柱，把每3 mL流出液收集到单个试管中，共收集20 mL流出液，并且分别检测出各段流出液中食品添加剂的总含量及回收率，以确定C18固相萃取柱净化过程需要加入的淋洗液体积数。以糕点作为基质的洗脱曲线如图2，从洗脱曲线可以看出，7种食品添加剂在C18固相萃取柱上于15 mL之前流出。糕点作为空白基质的实验结果与其他3种基质的实验结果具有相同的规律。因此，本方法确定收集15 mL洗脱液时可以保证在最大程度地除去基质干扰物的同时使7种食品添加剂组分的回收率符合检测的要求。
2.3 质谱条件的优化
以1 μg/mL浓度的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)和 特丁基对苯二酚(TBHQ) 、对羟基苯甲酸甲酯(MP)、对羟基苯甲酸乙酯(EP)、对羟基苯甲酸丙酯(PP)和对羟基苯甲酸丁酯(BP)7种食品添加剂标准溶液，针泵进样进入质谱系统。采用Q1全扫描和和碎片离子扫描的方式分别确定各种标准物质的母离子与子离子，并优化相关参数，表1为BHT、BHA、TBHQ、MP、EP、PP和BP 7种食品添加剂的的优化质谱条件。
表1 质谱优化条件
Table 1 The mass spectrum optimized conditions
注：加“*”的离子用于定量。
2.4 质谱检测条件选择实验
通过针泵进样，进行Q1全扫描，选择合适的母离子和子离子后，进行MRM多反应监测扫描，优化设定了去簇电压(DP)、入口电压(EP)、碰撞能量(CE)、出口电压(CXP)、气帘气(CUR)、碰撞气(CAD)、离子源温度(TEM)、辅助气1(Gas1)、辅助气2(Gas2)等参数。2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT，38.99 min)、丁基羟基茴香醚(BHA，14.43 min)和 特丁基对苯二酚(TBHQ，5.41 min)、对羟基苯甲酸甲酯(MP，3.46 min)、对羟基苯甲酸乙酯(EP，5.50 min)、对羟基苯甲酸丙酯(PP，9.91 min)和对羟基苯甲酸丁酯(BP，14.50 min)7种食品添加剂标准品的多反应监测(MRM)色谱图见图3。
图3 七种食品添加剂标准品溶液多反应监测色谱图
Fig.3 MRM chromatogram of standard solution of seven food additives
2.5 检出限和线性范围
在本方法所确定的LC-MS/MS检测条件下，以信噪比(S/N)为10时的待测物浓度作为测定低限，用甲醇将配制的混合标准溶液按梯度依次用甲醇稀释成待测定的低浓度系列标准溶液，然后进行测定。以峰面积对应于各标准物质的质量浓度(mg/L)进行线性回归，实验结果表明二者呈现良好的线性关系(见表2)，测定低限为0.03～0.14 mg/kg。
表2 方法的线性范围和测定低限
Table 2 Linearity range and detection limits
2.6 方法的精密度和回收率
采用添加法，选择不含上述7种抗氧化剂和防腐剂的食品为空白样品基质，如糕点，进行低、中、高3个浓度水平的添加实验，然后进行回收测定。平行测定10次，测定结果详见表3。经试验结果表明，平均添加回收率在85.8%～97.0%，相对标准偏差在4.18%以内，实验测定的精密度和回收率符合国家对残留分析准确度的要求。在此基础上对未检出上述7种抗氧化剂和防腐剂的其他9种样品基质(水果罐头、腌鱼罐头、白酒、果酒、饮料、海鲜酱油、糖果、调味酱和泡菜)也进行了上述的添加回收实验，对结果进行分析后发现平均回收率均在80.4%～98.5%之间、相对标准偏差均在1.63%～7.6%之间合理范围内，测定结果比较满意。
2.7 实际样品含量的测定
在上述实验条件下，分别对10种不同样品进行了测定，测定结果见表4。
表3 方法的精密度和回收率(n=10)
Table 3 Precision and recovery(n=10)
表4 实际样品的测定结果
Table 4 The measured results of actual samples
3 结论
本实验采用固相萃取净化技术与液相色谱-串联质谱联用技术建立了多种食品基质(水果罐头、腌鱼罐头、白酒、果酒、饮料、海鲜酱油、糖果、糕点、调味酱和泡菜)中同时测定2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)、特丁基对苯二酚(TBHQ) 、对羟基苯甲酸甲酯(MP)、对羟基苯甲酸乙酯(EP)、对羟基苯甲酸丙酯(PP)和对羟基苯甲酸丁酯(BP)七种抗氧化剂和防腐剂残留量的检测方法，采用外标法进行定量、并选择离子检测进行阳性确证，具有测定结果准确、线性范围宽、灵敏度高的优点，能够适用于高质量检测的要求。
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Determination of seven phenolic antioxidants and of p-hydroxybenzoate antiseptics in various foods by LC-MS/MS method
Abstract：A analytical method for detecting Phenolic Antioxidants and Ofp-hydroxybenzoate Antiseptics, 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol(BHT), Butylated hydroxyanisole(BHA),4-Hydroxybenzoic acid-methyl ester(MP), 4-Hydroxybenzoic acid-ethyl ester(EP), 4-Hydroxybenzoic acid-propyl ester(PP), and 4-Hydroxybenzoic acid-iso-butyl ester(PP) in various foods including canned fruit, canned fish, white spirit, fruit wine, beverages , hoisin sauce, candy, cake, sauce and pickle by liquid chromatography tandem mass spectrometry was studied . The samples were extracted by a solution of saturated sodium sulphate anhydrous (the pH was adjusted to 2-3 by phosphoric acid ) and methyl alcohol. The influence of extract solvent and the way of purification was investigated based on extraction quantities of antioxidants and antiseptics . Extraction liquid was separated by a Kromasil 100-5 column(150 mm×2.1 mm×5.0 μm)and quantified by external standard method of multiple reaction monitoring mode. The calibration curves showed good linear for 7 antioxidants and antiseptics with correlation coefficients from 0.992 8-0.999 6. The determination limits of 7 antioxidants and antiseptics were between 0.03 mg/kg and 0.14mg/kg. The samples were fortified at the low, middle and high level with the mixed standard solution of 7 antioxidants and antiseptics, the recoveries of this method and the relative standard deviations were 85.8%-97.0% and 1.43%-4.18%(n=10). The method is accurate, sensitive and reproducible, and is suitable for the determination of above seven antioxidants and antiseptics.
Key words：antioxidant; antiseptic;liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)
DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201611036
基金项目：国家质检总局项目(20121K162,20141K135)
收稿日期：2016-03-29，改回日期：2016-05-03